Diplômé de journalisme, détenteur d'un doctorat en communications, Robert Vaughn débute au cinéma dans Les Dix Commandements de Cecil B. DeMille. Non crédité au générique, il se fait remarquer en 1957 en incarnant Bob Ford dans Le Carrefour de la vengeance où il incarne le tueur de Jesse James.
A l'aise dans le western et repéré pour son physique particulier, l'acteur intègre deux ans plus tard le casting du film John Sturges, Les sept mercenaires. Vaughn y joue Lee, un mercenaire paranoiaque qui court vers la mort pour y trouver la paix. Pourtant Vaughn peine à trouver véritablement des premiers rôles au cinéma. Il trouve toutefois une belle notoriété à la télévision avec la série "Des agents très spéciaux" qui démarre dès 1964 et durera 4 saisons. En 1968, face à Steve McQueen, il campe le méchant de Bullitt.
Doué pour incarner les méchants, il reviendra plusieurs fois dans Columbo pour jouer les meurtriers au cours des années 70. Au cours des années 80, Vaughn revient au cinéma pour jouer dans Superman III et SOB de Blake Edwards. C'est à la télévision qu'on fait le plus appel à lui puisqu'on le voit régulièrement dans des séries comme Agence tous risques, Une nounou d'enfer, Walker, Texas Ranger, Arabesque et New York police judiciaire.
