Au cinéma, il a connu un grand succès pour son interprétation d'Albert dans le film de Mike Nichols The Birdcage pour laquelle il a été nommé au Golden Globe. Il a été l'un des interprètes de La Souris de Gore Verbinski, Peines d'amour perdues de et avec Kenneth Branagh, Les Valeurs de la famille Addams de Barry Sonnenfeld, Frankie et Johnny de Garry Marshall ou encore Austin Powers-Goldmember .
Nathan Lane a prêté sa voix à Timon dans les dessins animés Le Roi Lion coréalisé par Rob Minkoff, et sa suite, Le Roi Lion 2. Il a également été celle du chat Snowbell dans Stuart Little et Stuart Little 2 de Rob Minkoff.
Comédien plébiscité, bien connu pour ses prestations à Broadway, Nathan Lane a reçu en 1996 le Tony Award, l'Outer Critics Circle Award et le Drama Desk Award pour « A Funny Thing Happened on the Way to the Forum », mise en scène par Jerry Zaks. Nathan Lane a remporté par ailleurs deux Daytime Emmy Awards de la meilleure prestation pour un programme d'animation pour son travail sur la série « Timon et Pumba » et pour « Teacher's Pet ». Il joue actuellement « The Odd Couple » de Neil Simon, dont la première a eu lieu à Broadway le 27 octobre 2005. On a pu le voir auparavant dans l'adaptation par Stephen Sondheim des « Grenouilles » d'Aristophane, dont il a écrit le livret.
Le 15 mars 2006 nous le retrouvons à l'affiche du film de Susan Stroman, Les Producteurs. Nathan Lane reprend ici le rôle qu'il a créé dans la comédie musicale qui triompha à Broadway. Son interprétation de Max Bialystock sur scène lui a valu le Drama Desk Award, l'Outer Critics Circle Award et le Tony Award du meilleur comédien dans un spectacle musical en 2001.
