Dès l'âge de 13 ans, Stéphane Rousseau suit les traces des stand-up comiques américains qu'il admire. Il se forme à la dure école des clubs et des cabarets québécois.
Au fil des années, il devient un animateur de radio très prisé. Et puis quand la passion de la scène le reprend en 1991, sa facilité à manier l'humour et ses talents de danseur, chanteur, musicien et dessinateur lui permettent d'obtenir le Félix du Meilleur Spectacle d'Humour (1993), le "Billet Double Platine" (1994) et de vendre, en deux spectacles, 425 000 billets (1995). Les captations vidéo de ses deux spectacles sont "Vidéo d'Or" (1997).
Stéphane Rousseau se distingue particulièrement lors du spectacle du Jour de l’An 1999 que Céline Dion a donné à Montréal devant 25 000 personnes au Centre Bell.
En 2000, son spectacle remporte les prix de Meilleure performance scénique et Spectacle le plus populaire au Québec.
À l'automne 2001, Stéphane séjourne à Paris où il occupe la scène du Bataclan pendant 45 soirs.
Depuis le temps qu’il rêvait de faire du cinéma, c’est en 2002 que ses désirs deviennent
réalité alors qu'il joue un des personnages principaux du film Les Dangereux.
En juillet 2002 et 2003, à l’occasion des Galas Juste pour Rire, il coanime avec Franck Dubosq le "Gala des Français", présenté par la suite sur France 2 par Laurent Ruquier. Un résultat très probant, des cotes d’écoute de plus de 6 millions de spectateurs.
À la même époque, Stéphane Rousseau décroche un des rôles principaux du désormais très célèbre et oscarisé film de Denys Arcand Les Invasions Barbares (Barbarian Invasions), la suite du Déclin de l'empire américain. La première mondiale a lieu en mai 2003 et avant même son apparition sur les écrans québécois, il est sélectionné par le jury dans le cadre du Festival de Cannes et remporte, entre autres, le prix du Meilleur scénario.
Stéphane participe, par la suite, aux Festivals de films de Toronto (où il remporte le prix Génie dans la catégorie Meilleur acteur de soutien), de New York et de Valladolid.
Après Chicago, la comédie musicale où il a incarné le rôle principal dans la distribution de Paris, il rentre à Montréal pour y préparer son spectacle présenté un peu partout au Québec de mai à octobre 2005. À l'automne 2005, après plus de 100 représentations, il s’est envolé pour la France afin d’y faire sa rentrée parisienne. Il revient par la suite poursuivre sa visite des salles québécoises en mai 2006.
En 2008, il est l'affiche du troisième Astérix dans le rôle d'Alafolix et donne la réplique à Alexandra Lamy dans le film Modern love.
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