Né à Brooklyn, New York, Steve Buscemi grandit à Long Island. Il étudie au Lee Strasberg Institute, et passe deux ans sous la tutelle de John Strasberg. Il conçoit avec un ami acteur et écrivain, Mark Boone Jr., des pièces originales pour des clubs du Lower East Side de Manhattan, ce qui le conduit à travailler dans des productions off-off Broadway, notamment pour La MaMa, ETC, et Performing Garage. C'est à la suite de ces différents spectacles qu'il est choisi pour jouer l'un des premiers rôles de Clins d'oeil sur un adieu de Bill Sherwood, qui remporte en 1986 le Prix du meilleur film à l'USA Film Festival.
On le retrouve ensuite dans New york stories, pour l'histoire mise en scène par Martin Scorsese, Mystery Train de Jim Jarmusch, qui lui vaut une nomination à l'IFP Spirit Award en 1989, et In the soup, d'Alexandre Rockwell, lauréat du Prix du Jury du Festival de Sundance 1992. On le remarque aussi dans deux superproductions de Jerry Bruckheimer : Armaggedon de Michael Bay et Les ailes de l'enfer de Simon West. Parmi ses autres films figurent Domestic disturbance de Harold Becker, Los angeles 2013 de John Carpenter, Dernieres heures à Denver de Gary Fleder, Ça tourne à Manhattan de Tom DiCillo, avec Dermot Mulroney et James LeGros. Il a été Mr. Pink dans Reservoir Dogs de Quentin Tarantino, pour lequel il a obtenu un IFP Spirit Award du meilleur second rôle, puis a retrouvé le metteur en scène pour Pulp fiction, dans un petit rôle.
On a pu le voir également dans Les imposteurs de et avec Stanley Tucci, Les arnaqueurs de Stephen Frears, Soleil levant de Philip Kaufman, Kansas City de Robert Altman, Twenty Bucks de Keva Rosenfeld, Somebody to love et Big Daddy de Dennis Dugan et Demain on se marie de Frank Coraci. A quoi il faut ajouter 28 jours en sursis de Betty Thomas, Double Whammy de Tom DiCillo, Les aventures de mister Deeds de Steven Brill, Romance et cigarettes de John Turturro, Big Fish de Tim Burton, The Island de Michael Bay... Steve Buscemi a tourné cinq films sous la direction des frères Coen : The big Lebowski, Fargo, Le grand saut, Barton Fink et Miller's Crossing.
Sa première réalisation, dont il est aussi interprète et scénariste, est un court métrage : What Happened To Pete. En 1996, il signe Happy Hour, présenté lors de la Quinzaine des réalisateurs au Festival de Cannes. Son deuxième long métrage comme réalisateur, Animal Factory, participe au Festival de Sundance et connaît un important succès en salles. Par la suite, il réalise deux épisodes de la série Les Soprano, et a été nommé à l'Emmy Award et au Prix de la Directors Guild pour l'épisode "Pine Barrens". En 2007 il est dans Delirious de Tom DiCillo, puis face à Sienna Miller dans Interview. En 2008, il prête sa voix à Scamper dans le dessin animé Igor.
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