Barbara Lukešová a obtenu son diplôme du Conservatoire d'État de Prague. Par la suite, elle a joué au Théâtre F. X. Šalda à Liberec et plus tard avec le Théâtre Rokoko à Prague (1994-2001). Parallèlement, elle se produisait au Théâtre de la rue Celetna. Elle a également participé à diverses productions du Théâtre Rubín, du Théâtre national, des Théâtres municipaux de Prague, du Divadlo Komedie et du Théâtre de la rue Řeznická.
Elle a joué dans Brucio nel vento (It.) qui a remporté 5 prix et reçu 16 nominations. Le réalisateur du film, Silvio Soldini, a été sélectionné pour la compétition principale du prix de l'Ours d'or au Festival international du film de Berlin en 2002.
En 2013, elle figurait parmi les fortes candidates au Prix Alfréd Radok, nominée par les critiques de théâtre dans la catégorie Meilleure actrice pour son interprétation du rôle « A » dans la pièce Terminus mise en scène par M. Němec.
Grâce à sa maîtrise des langues (elle parle l'anglais, le russe et l'italien), elle a également été engagée dans des productions internationales.