Barton MacLane a obtenu son diplôme de l'Université Wesleyan, où il a démontré un don remarquable pour le sport, particulièrement le football et le basketball. Il n'est donc pas surprenant que son athlétisme l'ait conduit à un premier rôle dans The Quarterback (1926) aux côtés de Richard Dix. MacLane a un jour commenté que, en tant qu'acteur, il devait posséder la force physique nécessaire pour réduire les méchants « en miettes », si besoin était. Ironiquement, c'est généralement Barton lui-même qui se retrouvait au bout des coups (ou se prenait des balles à la place), habituellement dans les rôles de sbires grognons, de hors-la-loi et autres personnages douteux ou agressifs tout au long de ses quarante années de carrière au cinéma. En fait, Barton a été tellement typé que son nom a servi pendant un temps à décrire de manière proverbiale un voyou criard et sans scrupules.
Après sa formation à l'American Academy of Dramatic Arts, MacLane a rejoint une compagnie théâtrale à Brooklyn. En 1927, il a eu son premier rôle à Broadway, un bref moment en tant qu'assistant procureur, dans le mélodrame « The Trial of Mary Dugan ». Il a ensuite joué un petit rôle de policier dans « Subway Express » (1929-1930), un drame se déroulant à l'intérieur d'une rame de métro. Au milieu de 1932, MacLane a tenté sa chance en écrivant sa propre pièce de théâtre, intitulée « Rendezvous ». Bien que la pièce ait fermé après seulement vingt-et-une représentations, cela lui a valu un contrat avec Warner Brothers.
Barton avait déjà joué de petits rôles pour Paramount aux studios d'Astoria, notamment dans le premier film des frères Marx, The Cocoanuts (1929). Il a incarné le gangster Brad Collins dans « G » Men (1935) avec James Cagney, ce qui a donné le ton à la plupart de ses futurs rôles. Musclé, avec des yeux plissés et une voix rauque, MacLane était le parfait truand bourru, particulièrement adapté aux westerns et aux films noirs dans lesquels Warner Brothers excellait. Il a souvent été engagé pour jouer des policiers, qu'ils soient corrompus ou honnêtes. Parmi ses interprétations les plus représentatives figurent le gangster Al Kruger dans Bullets or Ballots (1936), qui lui a valu certaines des meilleures critiques de sa carrière ; le hors-la-loi Jack Slade dans Western Union (1941) ; le contremaître véreux Pat McCormick, qui se fait rouer de coups par Humphrey Bogart et Tim Holt pour salaires impayés dans Le Trésor de la Sierra Madre (1948) ; les policiers inflexibles, le détective Dundy dans Le Faucon maltais (1941) et le lieutenant Reece dans Kiss Tomorrow Goodbye (1950). MacLane, prêté à Universal, a également joué le rôle principal dans Prison Break (1938) en tant que pêcheur de thon innocent accusé à tort d'un meurtre. Il s'est distingué en tant que policier dur mais sympathique, faire-valoir de la jeune reporter détective Glenda Farrell dans la série « Torchy Blaine » du milieu à la fin des années 1930. Dans les années 1960, Barton a commencé à cultiver une image de bon garçon en tant que Marshal Frank Caine dans la série western NBC Outlaws (1960), ainsi qu'en apparaissant dans un petit rôle récurrent en tant que général de l'armée de l'air Martin Peterson dans Jeannie, c'est moi (1965).
Barton était marié à l'actrice Charlotte Wynters, qui a joué avec lui dans six de ses films. En dehors du tournage, le couple passait du temps dans leur ranch d'élevage de deux mille acres situé dans le comté de Madera, en Californie.
Pour son travail à la télévision, Barton possède une étoile sur le Hollywood Walk of Fame.
