Née en région parisienne, Isabelle Vitari démarre sa carrière d’actrice à l’âge de 25 ans, lorsqu’elle participe à la fiction française Dock 13, centrée sur les aventures de jeunes artistes installés dans un entrepôt menacé de démolition. Elle incarne ici une photographe, Emma, venue reconquérir son ex petit-ami coûte que coûte. En 2004, inséparable de son groupe d’amis surnommés "les quiches", elle écrit, réalise et joue dans le déjanté Foon. Le quatuor invite même Thierry Lhermitte et Denis Ménochet à rejoindre le casting de la comédie. La même année, elle figure dans plusieurs téléfilms, notamment Mon fils d’ailleurs avec Clémentine Célarié, et quelques séries populaires, comme l’incontournable P.J.
La belle côtoie, en 2007, Romain Duris et Fabrice Luchini sur les tournages du romantique Molière, avant d’apparaître dans le polar Mesrine : l’ennemi public n°1, porté par Vincent Cassel. Plus tard, Isabelle Vitari décroche un rôle dans le soap Seconde Chance, dans lequel elle campe la machiavélique Laëtitia Demarsey, directrice d’une agence de publicité. Puis, elle rejoint l’animateur Jean-Luc Reichmann dans deux épisodes de Victor Sauvage, ou Laurent Ournac, le temps d’une soirée au Camping Paradis. Pour son retour dans les salles obscures en 2010, la comédienne rencontre Clovis Cornillac, alors à l’affiche d’Une folle envie, et Diane Kruger dans le dramatique Forces spéciales.
En 2012, Isabelle Vitari devient l’un des personnages phares du programme court humoristique de TF1, Nos chers voisins. Dans la peau de Karine Becker, elle est la mère de deux ados en pleine puberté, travaillant dans une agence de voyages. Son partenaire est Gil Alma, alias Alain Stuck, son petit ami depuis la première saison du show. Dans le même temps, elle écrit et joue son premier spectacle, intitulé "Rires", sur les planches d'un théâtre de la capitale.
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