Diplômé de l'École des arts et métiers de Prague, il fonda en 1936 un théâtre de marionnettes, qui fut fermé après le déclenchement de la Seconde Guerre mondiale. Pendant la guerre, il conçut des décors de scène et illustra des livres pour enfants. En 1945, il créa une unité d'animation avec plusieurs collaborateurs au studio de cinéma de Prague ; ils baptisèrent cette unité « Frères du Truc ». Trnka s'était spécialisé dans l'animation de marionnettes, un art traditionnel tchèque dont il devint le maître incontesté. Il réalisa également des dessins animés, mais c'est son animation de marionnettes qui le rendit célèbre internationalement et lui permit de remporter des prix dans les festivals de cinéma à Venise et ailleurs. Il écrivit lui-même les scénarios de la plupart de ses films.