Né à Fairfield, dans le Connecticut, Justin Long a fait ses études à Vassar College et a été membre pendant 2 ans de la troupe comique de l’université, Laughingstock. Justin Long a été le partenaire de Bruce Willis dans Die hard 4, retour en enfer de Len Wiseman. Il a joué également dans Strange wilderness de Fred Wolf et Just add water, écrit et réalisé par Hart Bochner, avec Danny DeVito.
Il a tenu son propre rôle dans le documentaire Wild West Comedy Show : 30 Days & 30 Nights – Hollywood to the Heartland, produit par Vince Vaughn en 2008. On le retrouve ensuite dans la comédie romantique He's just not that into you, avec Jennifer Aniston, Scarlett Johansson, Jennifer Connelly, Drew Barrymore, Ginnifer Goodwin et Kevin Connolly.
Il prête sa voix à la souris Despereaux dans le film d’animation en images de synthèse The tale of Despereaux, aux côtés de Dustin Hoffman et William H. Macy, et à un personnage de Terra, autre film en images de synthèse sur une invasion humaine sur une planète étrangère, tiré d’un scénario écrit par Chris Viscardi et Will McRobb, les scénaristes de Alvin et les Chipmunks.
Justin Long a été le flamboyant coiffeur de Jennifer Aniston dans la comédie romantique de Peyton Reed La rupture. Il a joué aussi dans The sasquatch dumpling gang, une comédie produite par Kevin Spacey et Jared Hess et réalisée par Tim Skousen qui a obtenu le Prix du public du meilleur film narratif au Slamdance Film Festival, ainsi que dans le film indépendant Dreamland de Jason Matzner, un film sur le basket où il a pour partenaire Agnes Bruckner.
Justin Long a débuté au cinéma dans Galaxy qyest de Dean Parisot, avec Tim Allen et Sigourney Weaver et Happy campers de Daniel Waters. Il a joué par la suite dans Jeepers creepers, le chant du diable, écrit et réalisé par Victor Salva en 2001, et Crossroads de Tamra Davis, avec Britney Spears, ainsi que dans Raising genius de Linda Vorhees et Bess Wiley, avec Wendie Malick et Stephen Root.
En 2004, il a prêté sa voix au film d’animation de Bill Plympton Hair high et a joué face à Ben Stiller et Vince Vaughn dans la comédie à succès Même pas mal ! de Rawson Marshall Thurber. En 2005, Justin Long a été l’interprète de Waiting de Rob McKittrick, avec Ryan Reynolds et Anna Harris, produit par Chris Moore.
Il a également été le petit ami de Lindsay Lohan dans la comédie La coccinelle revient, avec Breckin Meyer, Matt Dillon et Michael Keaton. Il a joué en 2006 dans le film de Steve Pink, Accepted, ainsi que dans Idiocracy, écrit et réalisé par Mike Judge, et interprété par Luke Wilson, Maya Rudolph et Dax Shepard.
En 2007, il prête sa voix à Alvin, un écureuil-chanteur dans Alvin et les Chipmunks et en 2009, on le retrouve à l'affiche de Ce que pensent les hommes de Ken Kwapis, aux côtés de Ben Affleck et Jennifer Aniston. La même année, on le retrouve dans le thriller horrifique Jusqu'en enfer, réalisé par Sam Raimi. Le film fait partie de la Sélection officielles hors compétition du Festival de Cannes 2009. La même année, il rempile pour la suite d'Alvin et les Chipmunks, réalisée par Betty Thomas.
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