Née en Belgique, elle fait ses premières armes chez les majorettes ("Là où j'habitais, en Belgique, il n'y avait ni cours de théâtre ni cinéma. Il a fallu faire avec"). Fascinée par le monde du spectacle, vers 7-8 ans, elle se déguise et organise de petits spectacles avec sa petite sœur Céline et les enfants du village dans L'atelier Pomme improvisé dans le grenier.
Adolescente, elle fait partie de l'atelier d'expression théâtrale pour adolescents Le Vivier. Puis elle enchaîne cours de danse et cours de comédie, ce qui entraîne bien souvent des frictions avec sa famille.
A 14 ans, elle fait du théâtre dans une troupe amateur de Liège. 2 ans plus tard, elle est repérée pour jouer au côtés de Gérard Depardieu dans Mon Père, ce héros, ce qui ne l'empêche pas de reprendre le chemin des castings.
Elle tourne ensuite Marie (son unique film belge jusqu'à présent) et le téléfilm Un homme à la mer de Jacques Doillon, tout en terminant ses études secondaires au Collège Saint-Louis à Liège. Puis, pendant 4 mois, elle suit des cours (de chant, de danse, de théâtre, d'acrobaties, et cetera) à l'Ecole du Cirque de Bruxelles,
Bertrand Tavernier lui offre sa 2ème chance dans L'appât, sans pour autant passer par un bout d'essai. 1995 Marie Gillain fait ses débuts sur les planches, dans Le Journal d'Anne Frank. Après une cinquantaine de représentations à Lyon, la pièce fait un triomphe à Paris. Ce rôle lui rapporte d'ailleurs une nomination pour la Révélation théâtrale de l'année à la 10ème Nuit des Molières.
Avant de partir en tournée en Belgique, elle tourne en Toscane Les Affinités Electives des frères Taviani, présenté hors compétition au 49ème Festival de Cannes.
Après le tournage de Un air si pur en Pologne en 1996, Marie participe à L'Orchestre à la portée des enfants, une série de concerts organisés par les Jeunesses Musicales de Liège et de Bruxelles avec l'Orchestre Philharmonique de Liège dans le but de faire découvrir la musique symphonique aux enfants. Elle y raconte La Boîte à joujoux de Claude Debussy, L'Histoire de Babar de Francis Poulenc et Pierre et le Loup de Serge Prokofiev. Expérience qu'elle renouvelle la saison suivante avec Casse-Noisette de Piotr Ilitch Tchaïkovski, L'apprenti sorcier de Paul Dukas et Ma mère l'Oye de Maurice Ravel.
En 1997, on retrouve Marie dans Le Bossu, film de cape et d'épée à gros budget. Grâce à son rôle d'Aurore de Nevers, elle se retrouve nommée dans la catégorie Meilleure actrice aux Césars 1998. Après un creux, elle revient dans Le Dîner de Ettore Scola et Le Dernier Harem de Ferzan Ozpetek, présenté dans la sélection Un certain regard à Cannes en mai 1999.
Marie Gillain signe en 1998 un contrat avec Lancôme, sur l'Asie. Il lui apporte la sécurité financière qui lui permet de faire des choix plus osés quant aux scénarios. Après avoir tourné avec des réalisateurs confirmés, Marie tente l'expérience avec de jeunes réalisateurs: Laissons Lucie faire d'Emmanuel Mouret et Barnie et ses petites contrariétés de Bruno Chiche. Elle semble avoir pris goût à la comédie, car elle enchaîne avec Absolument fabuleux de Gabriel Aghion. Ensuite, elle interprète un petit rôle dans Laissez-passer de Bertrand Tavernier
2004 Marie Gillain perd soudain... son plaisir sexuel et se lance désespérément dans une folle quête pour le retrouver... dans le long métrage de Isabelle Broué Tout le plaisir est pour moi.
L'année suivante, elle tourne dans L'Enfer, de Danis Tanovic, Film pour lequel elle déclare : "Le tournage de ce film a été pour moi un vrai cadeau de cinéma et une rencontre importante avec un metteur en scène. J'ai eu toutes ces sensations que l'on éprouve la 1ère fois que l'on fait un film. Cette excitation et ce bonheur de se lever le matin pour aller tourner, cette alchimie de groupe qui nous donne une énergie incroyable pour avancer... et un plaisir immense et enfantin d'être dirigée par Danis, car c'est évidemment grâce à lui que nous avons souri pendant toutes ces semaines".
Depuis, elle a été à l'affiche de Pars vite et reviens tard, Fragile(s), dans le film de Marc Gibaja, Ma vie n'est pas une comédie romantique et La clef, le film de Guillaume Nicloux avec Guillaume Canet.
En 2008, elle se lance dans la résistance aux côtés de Sophie Marceau et Julie Depardieu dans le long-métrage de Jean-Paul Salomé, Les femmes de l'ombre et revient quelques mois plus tard aux côtés du Chanteur Cali dans Magique ! de Philippe Muyl, et dans La très très grande entreprise de Pierre Jolivet.
César 2012 : nominée pour le César de la meilleure actrice pour Toutes nos envies
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