Né en Australie, Sam Worthington est sorti diplômé du National Institute of Dramatic Art de Sydney en 1998. Il a joué sur scène Judas Kiss de Neil Armfield avec la Company B au Belvoir Street Theatre.En 2000, il a fait ses débuts sur le grand écran avec un rôle principal dans le film australien Bootmen de Dein Perry, où il incarnait le frère aîné d’Adam Garcia. Il a été nommé à l’Australian Film Institute Award du meilleur acteur. Il a ensuite été nommé au Film Critics Circle of Australia Award du meilleur second rôle pour Dirty deeds de David Caesar, avec John Goodman, Toni Collette et Sam Neill, et a joué dans un autre film australien, Gettin’ squarede Jonathan Teplitzky, avec David Wenham. Il a aussi tenu un petit rôle dans Mission évasion de Gregory Hoblit, avec Bruce Willis.C’est son interprétation dans le film de Cate Shortland Somersault, succès critique et public de 2004, qui lui a valu une reconnaissance internationale. Il a reçu l’AFI du meilleur acteur et sa deuxième nomination au FCCA Award. Le film a aussi fait l’événement aux AFI Awards : il a été vainqueur dans la totalité des 13 catégories, une première dans l’histoire de l’Australian Film Institute.Sam Worthington tient ensuite le rôle-titre de l’adaptation contemporaine de l’œuvre de Shakespeare MacBeth par Geoffrey Wright en 2006. Il a joué également dans Le grand raid de John Dahl et le thriller d’horreur Solitaire de Greg Mclean.En 2009, il partage l'affiche du très attendu Terminator renaissance de McG, aux côtés de Christian Bale. Il enchaîne avec les tournages du film de science-fiction en 3D de James Cameron, Avatar (sur les écrans en décembre 2009) et de 2 films indépendants : le drame romantique Last night de Massy Tadjedin, avec Keira Knightley et Eva Mendes, et le thriller dramatique se déroulant après la Seconde Guerre mondiale, The debt de John Madden, avec Helen Mirren. Il tourne également le film fantastique d'action et d'aventure Clash of the titans, dans lequel il tient le rôle de Persée sous la direction de Louis Leterrier. Côté télévision, il a tenu des rôles principaux dans deux productions primées, Love My Way, qui a remporté trois AFI Awards de la meilleure série télévisée, et The Surgeon. Il a aussi joué dans un épisode de Two Twisted, une série d’anthologie dans la ligne de La Quatrième Dimension produite par Bryan Brown. En 2009, il joue dans Avatar de James Cameron.
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