Ana Gasteyer est surtout connue pour son extraordinaire prestation dans l'émission Saturday Night Live. Pendant 6 ans, elle a créé plusieurs personnages dont le professeur de musique de primaire Bobbie Moughan-Culp, l'animatrice radio Margaret Jo, la poètesse Cinder Calhoun, et est connue pour ses imitations de Martha Stewart, Celine Dion et Hillary Clinton.
A la télévision, on l'a vue dans Frasier, Voilà ( Just Shoot Me), NYPD Blue, New York District ( Law & Order), La Vie à cinq et Seinfeld.
Avant de rejoindre l'équipe de Saturday Night Live, Ana Gasteyer était l'un des piliers de The Groundings, théâtre de Los Angeles spécialisé dans l'improvisation. Elle a fait ses débuts sur Broadway dans The Rocky Horror Picture Show. On l'a également vu dans Les Monologues du Vagin. A l'écran, elle a joué dans Mean Girls, face à Lindsay Lohan et dans What's the Worst That Could Happen, avec John Leguizamo et Martin Lawrence.
Le 1er mars 2006 elle est à l'affiche de la comédie musicale déjantée de Andy Fickman, Reefer madness.
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