Le L au milieu entre son prénom et son nom, c'est pour "Leroy". Né le 21 décembre 1948 à Washington dans le district de Columbia, Samuel L. Jackson fait ses études au Morehouse College d'Atlanta dont il est diplômé en Art Dramatique. Il débute au théâtre dans des pièces comme Home, A soldier's play, Sally/Prince et The District Line.
Il a créé les rôles de deux pièces d'August Wilson au Yale Repertory Theatre et, pour le New York Shakespeare Festival, joue dans Mère courage et ses enfants, Spell #7 et The mighty Gents.
Il tient son premier rôle au cinéma dans Together for days de Michael Schultz, alors qu'il est encore étudiant. Malgré de nombreux rôles pour Forman, Landis, Scorsese ou Spielberg, il est découvert par le public grâce à son interprétation d'un accro du crack dans Jungle Fever de Spike Lee : ce film lui permet même d'obtenir au Festival de Cannes le Prix d'interprétation pour un second rôle, un prix qui n'avait jamais été décerné jusqu'alors. Il remportera aussi un New York Film Critics Award du meilleur second rôle. Quand la vie rejoint la fiction... Sam, toxicomane notoire, n'est sorti de cure de désintoxication que deux semaines avant le début du tournage.
En 1996, il joue dans l'adaptation du roman de John Grisham par Joel Schumacher Le droit de tuer ?, et obtient une autre citation au Golden Globe et un NAACP Image Award.
Il a obtenu le BAFTA Award et a été cité à l'Oscar et au Golden Globe du meilleur second rôle pour son interprétation de Jules, le tueur à gages du film de Quentin Tarantino Pulp Fiction. Il a remporté le Prix d'interprétation au Festival International de Berlin et a été nommé au Golden Globe du meilleur acteur pour Jackie Brown du même réalisateur.
Le droit de tuer ? et Jungle fever l'avaient déjà révélé comme un acteur complet. L'effet Quentin Tarantino - qui a relancé la carrière de Bruce Willis et John Travolta - fonctionne aussi sur lui. Sa côte explose, et il tient désormais le haut de l'affiche dans des grosses productions et des films d'action survitaminés : Die hard 3, une journée en enfer, Sphère, Star wars ep. 1, 2 et 3, Peur bleue, L'enfer du devoir, Shaft, Le 51ème état - sur un scénario de fan reçu par la poste, qu'il porta lui-même aux studios - XXX 1 et 2, Basic, SWAT...
Son image "cool" - béret mode souvent vissé au crâne - est aussi associée sans complexes aux séries B comme Des serpents dans l'avion ou Le Boss. Ce qui ne l'empêche pas de s'octroyer de temps en temps les faveurs de réalisateurs dits d'"auteur", comme M. Night Shyamalan (Incassable) ou Roger Michell (Dérapages incontrôlés).
Il est en 2007 aux côtés de Christina Ricci dans Black Snake Moan et l'année suivante, il traque Hayden Christensen qui a délaissé son sabre laser pour un pouvoir plutôt attrayant : la téléportation. L'ex-Jedi est un Jumper, affranchi des frontières. L'année suivante, il est face à Eva Mendès dans le thriller Cleaner de Renny Harlin.
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