A la suite de la tentative d'assassinat de la belle Mathilde, fille du célèbre Pr. Stangerson, le jeune reporter Joseph Rouletabille et son ami photographe Sainclair se rendent au Château du Glandier pour élucider le mystère. Qui est l'agresseur ? Quel est son mobile ? Et comment a-t-il pu s'échapper de la chambre jaune, fermée de l'intérieur ?